Í því ferli að gera erfðafræðilegar rannsóknir lendum við oft í ófullnægjandi RNA sýnum, til dæmis til að rannsaka örsmá líffæraæxli í munni, jafnvel einfrumusýni og sýni af sérstökum genum stökkbreytingum sem eru umrituð í mjög litlu magni í frumum manna.Auðvitað, fyrir COVID-19 prófið, ef þurrkarnir eru ekki á réttum stað eða ekki nógu oft við sýnatöku, verður úrtaksstærðin mjög lítil, þess vegna kom heilbrigðis- og fjölskylduskipulagsnefnd út fyrir tveimur dögum og stóðst prófið og ef kjarnsýrusýnandinn tók ekki sex sýni geturðu tilkynnt það.
Næmi hvarfefnisins er mikilvægt vegna þess að við höfum þetta vandamál eða vandamálið, svo hvað getum við gert til að bæta næmni RT-PCR?
Áður en við ræðum mögulegar lausnir skulum við nefna tvo stóra fylgikvilla við ástandið sem við nefndum.
Í fyrsta lagi höfum við áhyggjur af RNA tapi þegar við höfum aðeins nokkra frumuhópa í sýninu okkar.Ef notaðar eru hefðbundnar aðskilnaðar- og hreinsunaraðferðir, eins og súluaðferð eða kjarnsýruútfellingaraðferð, eru miklar líkur á að þessi fáu sýni glatist.Ein lausn er að bæta við burðarsameind, eins og tRNA, en jafnvel þá er engin trygging fyrir því að batatilraunin okkar sé í lagi.
Svo hvað er betri leið?Góður kostur fyrir ræktaðar frumur eða örlíffærasýni er að nota beina lýsu.
Hugmyndin er að skipta frumunum í 5 mínútur, losa RNA í lausnina, stöðva síðan efnahvarfið í 2 mínútur, bæta síðan lýsinu beint við öfugumritunarviðbrögðin þannig að ekkert RNA tapist og að lokum setja cDNA sem myndast beint beint við inn í rauntímaviðbrögðin.
En hvað ef, vegna takmarkaðs upphafspunkts eða lítillar tjáningar markgena, getum við endurunnið allt RNA og samt ekki útvegað nógu sniðmát til að fá gott rauntímamerki?
Í þessu tilviki getur formögnunarskrefið verið mjög gagnlegt.
Eftirfarandi er áætlun til að auka næmni eftir öfuga umritun.Áður en við byrjum þurfum við að spyrja niðurstreymis hvaða markmið við höfum áhuga á, til að hanna sérstaka primera fyrir þessi markmið til formögnunar.
Þetta er hægt að ná með því að búa til blandaðan grunn með allt að 100 pörum af grunni og hvarfhring sem er 10 til 14 sinnum.Þess vegna þarf Master Mix sem er sérstaklega hönnuð fyrir þessa kröfu til að formagna cDNA sem fæst.
Ástæðan fyrir því að stilla fjölda lota á milli 10 og 14 er sú að þessi takmarkaði fjöldi lota tryggir tilviljun á milli hinna ýmsu miða, sem skiptir sköpum fyrir vísindamenn sem þurfa megindlegar sameindaupplýsingar.
Eftir formögnun getum við fengið mikið magn af cDNA, þannig að greiningarnæmni í bakendanum er stórbætt, og við getum jafnvel þynnt sýnið og framkvæmt mörg rauntíma PCR viðbrögð til að útrýma mögulegum tilviljunarkenndum villum.
Birtingartími: 11. apríl 2023